Ny teknologi til udvikling af sub-unit vaccine

Louise von Gersdorff Jørgensen | Nov 2018 | #8C674A |

Louise von Gersdorff Jørgensen
lektor,
Parasitologi og Akvatisk Patobiologi,
Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet,
Københavns Universitet

Parasitsygdomme udgør et stort problem på verdensplan, og meget få vacciner er på markedet. Parasitter er komplekse organismer og spænder bredt. Indenfor parasitter findes meget små protozoer, eksempelvis Plasmodium som forårsager malaria og flere meter lange metazoer, som for eksempel bændelorme. 

Sammenlignet med virus og bakterier findes der i parasitter et væld af forskellige proteiner, og det kan være yderst kompliceret at identificere de mest velegnede proteiner, som kan bruges til at udvikle vacciner imod sygdommene. 

Bioteknologisk bliver der hele tiden udviklet nye programmer til at identificere disse velegnede proteiner (vaccinekandidater). Et af disse programmer, kaldet EDEN (udviklet af Evaxion Biotech), bruger kunstig intelligens til at udvælge de mest beskyttende proteiner. Ud fra en række forskellige parametre, såsom struktur, lokalisering og funktion træner programmet på allerede beskrevne effektivt beskyttende proteiner og lærer dermed hvordan proteinerne skal se ud for potentielt at inducere beskyttelse. 

Når man har hele genomet for den organisme man er interesseret i at udvikle en vaccine imod, kan dette blive analyseret af EDEN og samtlige hypotetiske proteiner vil blive ranket efter, hvor sandsynligt programmet estimerer det beskyttende potentiale til at være.

Efterfølgende er der et stort arbejde i at prøve, at få udtrykt proteinerne rekombinant og når dette er lykkedes, kan man begynde at teste proteinerne på dyr. Typisk vil man poole en række proteiner og hvis en af disse pools giver beskyttelse, kan man begynde at teste proteinerne en efter en og køre dosis/respons-forsøg. På denne måde kan nye vaccinekandidater identificeres, som kan indgå i sub-unit vacciner og være en del af profylaktisk forebyggelse.  

Vi har testet EDEN på en parasitsygdom, der forekommer i fisk. Denne sygdom kan til stadighed ikke kontrolleres ved vaccination, selvom vi mange gange har demonstreret, at fisk kan blive immune overfor sygdommen. Sygdommen kaldes hvidpletsyge (se billeder), eller fiskedræber og forårsages af parasitten Ichthyophthirius multifiliis (Ich). Ich er en encellet ciliat, der kan angribe næsten alle arter af ferskvandsfisk over hele verden (også akvariefisk) og forårsager høj dødelighed.

Parasitten angriber hud, finner og gæller hos fisk og borer sig ind under det yderste gennemsigtige cellelag, hvor den undergår en morfologisk forandring og begynder at æde cellemateriale fra fisken. Efter en modningsproces afhængig af temperaturen vil parasitten vokse op til 1 mm i diameter og forlade værten for at søge et bundsubstrat, hvorpå den kan encystere sig. Det er oftest i forbindelse med, at parasitten forlader fisken, at fisken dør. I cysten fremkommer 50-1000 nye parasitter, som vil søge nye ferskvandsfisk at snylte på. Ich har altså en direkte livscyklus og er dermed afhængig af fisk som værter og sygdommen kan kun kontrolleres ved gentagne vandbehandlinger med stoffer som natriumperkarbonat og formalin.1 

Fisk som karper, regnbueørred og maller kan opnå en meget effektiv naturlig immunitet imod Ich, hvilket sandsynliggør, at en effektiv vaccine kan udvikles. En forskergruppe i USA har identificeret et immunogent overfladeprotein (Iag52b), som efter oprensning fra parasitmateriale inducerer beskyttelse, når det sprøjtes ind i bughulen sammen med Freunds komplette adjuvans.2 Det er dog indtil nu ikke lykkes at dyrke parasitten i laboratoriet uden kontinuerlig brug af levende fisk, og dermed er en sådan vaccine-fremgangsmåde udsigtsløs. 

Iag52b har vist sig at være et komplekst protein og kan indtil nu ikke udtrykkes rekombinant i klassiske ekspressionssystemer som E. coli eller insektceller, med henblik på at blive brugt som vaccine. Det kan dog udtrykkes rekombinant i ciliaten Tetrahymena thermophila,3 men dette har ikke vist sig rentabelt. Derfor var vi på udkig efter en bioteknologisk løsning, både for at holde produktionsomkostningerne nede og for at holde produktionen uafhængig af selve parasitten. 

Formål
Formålet med vores undersøgelse var at benytte computerprogrammet EDEN, der som beskrevet ovenfor benytter kunstig intelligens til at identificere og rangere vaccinekandidater. Relevante vaccinekandidater ville dernæst blive udtrykt rekombinant og testet i en sub-unit vaccine. Programmet skulle screene hele Ich-proteomet, som er tilgængeligt i Genbank, og rangere alle Ich-proteinerne efter potentiel bedst beskyttende evne. 

Metode og resultat
Ud af de ca. 7200 proteiner, der blev fundet i Ich, blev de 12 højst rangerende udvalgt til yderligere analyse. Vi forsøgte at udtrykke proteinerne i E. coli og i insektceller, hvoraf fire proteiner gav negative resultater. Vi fik udtrykt otte proteiner og efter at have kørt et pilotforsøg med henblik på at udvælge de mest immunogene kandidater, udvalgte vi tre rekombinante proteiner til det endelige forsøg, hvoraf et var udtrykt i insektceller og to var udtrykt i E. coli. De tre proteiner skulle sammen med hjælpestoffer (adjuvanser) udgøre vores eksperimentelle sub-unit vaccine. 

I det endelige forsøg blev den eksperimentelle sub-unit vaccine sammenlignet med et homogenat af parasitten (benchmark vaccine). De tre proteiner og parasit-homogenatet blev hver for sig bundet til aluminiumhydroxid og blandet med Freund’s ukomplette adjuvans. 

Forsøget blev kørt i duplikat med 20 fisk i hvert kar (det vil sige 40 fisk pr. vaccine-gruppe) og fiskene blev vaccineret i bughulen med 150 µ vaccine. Efter ca. ti uger udsatte vi fiskene for parasitter, og efterfølgende udtog vi blod og bestemte parasitbyrden ved at tælle parasitterne på fiskene. Vi analyserede mængden af antistoffer i blodet, som var specifikke for Ich eller de rekombinante proteiner. Resultaterne viste, at vores eksperimentelle sub-unit vaccine beskyttede fiskene imod Ich næsten lige så godt som vores benchmark-vaccine, og at specielt det rekombinante protein, som blev udtrykt i insektceller, inducerede en høj produktion af antistoffer.

Diskussion
Vores forsøg viste, at det omtalte computerprogram kunne bruges til noget så kompliceret, som at udvælge potentielt beskyttende vaccinekandidater hos en parasit. Den inducerede beskyttelse, opnået ved hjælp af den eksperimentelle vaccine, var samlet set moderat og skal forbedres, hvis den skal kunne benyttes i akvakulturindustrien. Dette kan enten gøres ved at identificere flere beskyttende antigener og inkludere disse i vaccinen og/eller udvikle bedre adjuvanser. 

Hvis det lykkes at udtrykke overfladeproteinet Iag52b rekombinant på en økonomisk favorabel måde, vil en kombination af dette protein og vores rekombinante proteiner potentielt være højt beskyttende. Det ene protein, som inducerede et signifikant antistofrespons i vores forsøg, vil vi fortsat arbejde med og foretage dosis-responsstudier for at teste dets evne til at beskytte mod Ich i regnbueørred og andre fiskearter. 

Proteinet er beskrevet i Genbank som et ekstracellulært protein-bindende neurohypofysial n-terminalt domæne-protein, og som følge af vores resultater betragter vi dette protein som værende en ny og potentiel vigtig vaccinekandidat. EDEN er designet til at kunne identificere nye vaccinekandidater i bakterier, men det til trods var det i stand til at ranke parasitproteiner (det beskyttende antigen Iag52b blev ranket som nr. 26) og vi kan kun drømme om, hvad programmet ville kunne udvikle sig til i forhold til vores behov, hvis det blev trænet på parasitter. 

Da der generelt findes få vacciner imod parasitter, kan den beskrevne fremgangsmåde potentielt bane vejen for udviklingen af fremtidige anti-parasitiske vacciner.

Konklusion

Ved hjælp af et program der benytter kunstig intelligens, har vi formået at identificere et nyt moderat beskyttende protein i den encellede ciliat Ichthyophthirius multifiliis. Vi har bevist at metoden kan benyttes på parasitter på trods af, at programmet er udviklet til at identificere nye vaccinekandidater i bakterier. Der ligger stadig et stort arbejde foran os med at karakterisere det identificerede beskyttende antigen og udvikle en vaccine, der inducerer en høj beskyttelse. 

Artiklen fra 2017, der beskriver dette arbejde, kan findes i tidsskriftet Journal of Fish Diseases vol 40, side 1815-1821. Titel: Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) immune response towards a recombinant vaccine targeting the parasitic ciliate Ichthyophthirius multifiliis.

Interessekonflikter: Der er ingen interessekonflikter forbundet med dette studium.

Referencer

1. Jørgensen LVG. The fish parasite Ichthyophthirius multifiliis – Host immunology, vaccines and novel treatments. Fish Shellfish Immunol 2017;67:586-595. 2. Wang X, Clark T, Noe J, Dickerson H. Immunisation of channel catfish, Ictalurus punctatus, with Ichthyophthirius multifiliis immobilisation antigens elicits serotype-specific protection. Fish & Shellfish Immunology 2002;13(5):337-350. 3. Gaertig J, Gao Y, Tishgarten T, Clark T, Dickerson H. Surface display of a parasite antigen in the ciliate Tetrahymena thermophila. Nature Biotechnology 1999;17(5):462-465.