Brug af tørrede fæcesprøver til mikrobiologisk diagnostik og forskning

Sebastian von Huth | Nov 2018 | Infektionsmedicin |

Sebastian von Huth
reservelæge, ph.d.,
Institut for Molekylær Medicin,
Syddansk Universitet
og Infektionsmedicinsk Afdeling,
Odense Universitetshospital

Poul-Erik Kofoed
professor, overlæge, dr.med.,
Børneafdelingen, Kolding Sygehus
ved Sygehus Lillebælt,
Institut for Regional Sundhedsforskning,
Syddansk Universitet og Bandim Health Project,
Indepth Network, Bissau, Guinea-Bissau

Diarré er en yderst udbredt tilstand, som årligt forårsager over en million dødsfald på verdensplan.1 Til trods for en faldende prævalens er diarré fortsat en hyppig dødsårsag i lavindkomstlande, og en hyppig årsag til indlæggelse i højindkomstlande. 

Der er talrige ætiologier til diarré, både ikke-infektiøse og infektiøse, der kan være forårsaget af bakterier, vira og parasitter. Fordelingen af infektiøse agens varierer fra land til land og er blandt andet betinget af sanitære og hygiejniske forhold, alder og køn.

Mikrobiologisk diagnostik
Mikrobiologisk diagnostik af diarré er traditionelt baseret på mikroskopi og eventuel dyrkning. I lavindkomstlande er dette oftest eneste tilgængelige diagnosticeringsmetoder. I højindkomstlande har brugen af PCR (polymerase chain reaction) derimod gennem de seneste årtier revolutioneret den mikrobiologiske diagnostik, både hvad angår sensitivitet, specificitet og analysehastighed.2-4 

I hovedtræk beror teknikken på amplificering af DNA-sekvenser fra patogene agens. Man skelner mellem uni- og multiplex PCR, hvor førstnævnte amplificerer DNA-sekvens fra én agens, mens sidstnævnte amplificerer adskillige. Fordelen ved multiplex PCR er hurtigere output og påvisning af flere agens på samme tid, men der er samtidig risiko for falsk-positive eller falsk-negative resultater.5 Med den høje sensitivitet ved PCR-diagnostik risikerer man desuden at få positive fund, der er klinisk irrelevante.

Traditionelt har det været nødvendigt at opbevare prøvemateriale (fæces, urin, podning eller andet) på frost forud for DNA-ekstraktion. Mangel på fryserkapacitet og en stabil elektricitetsforsyning i især landområderne i udviklingslande vanskeliggør indsamlingen af prøver til undersøgelse og monitorering af årsagerne til diarré. Desuden kræver PCR-teknikken dedikeret og ofte dyrt laboratorieudstyr, hvorfor teknikken slet ikke er tilgængelig i mange lavindkomstlande. Derfor er aktuelle estimater angående ætiologien til diarrésygdomme i disse lande upræcise eller helt manglende. 

I et forsøg på at undgå afhængigheden af elektricitet og frysere i forbindelse med indsamling af prøver til epidemiologiske studier har der gennem de seneste ti år været forsket i brugen af tørrede fæcesprøver. Prøverne indsamles i felten, tørres på eksempelvis filterpapir og opbevares ved stuetemperatur, indtil de kan sendes til analyse centralt. 

Diagnostisk brug af tørrede fæcesprøver
Et amerikansk studie fra 2008 demonstrerede, at brugen af tørrede afføringsprøver på filterpapir er en pålidelig metode til påvisning af diarréfremkaldende E. coli-bakterier.6 I det pågældende studie blev fæcesprøverne opbevaret 300-400 dage ved rumtemperatur forud for DNA-ekstraktion, uden at dette påvirkede kvaliteten. Tilsvarende viste et tysk studie fra 2017, at filterpapirsprøver opbevaret i op til seks uger ved rumtemperatur kunne anvendes til påvisning af agens, der forårsager rejsediarré.7 Forfatterne demonstrerede, at man ved multiplex PCR kunne påvise både bakterier (Campylobacter), virus (norovirus) og amøber (Entamoeba histolytica) i disse prøver. 

For at undersøge anvendeligheden af tørrede fæcesprøver i epidemiologiske studier har vi udviklet en multiplex PCR-protokol, der direkte påviser Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. og Entamoeba histolytica.8 Vi har påvist sammenlignelige resultater mellem friske prøver og prøver opbevaret på filterpapir ved rumtemperatur i to uger. Metoden er særdeles sensitiv, idet den kan påvise parasitær DNA i yderst fortyndede prøver: Ned til 0,01 ng/ml DNA for E. histolytica, og ned til 0,1 ng/ml DNA for henholdsvis G. lamblia og Cryptosporidium spp.

I studiet anvendte vi desuden tørrede fæcesprøver indsamlet i Guinea-Bissau; Vestafrika, til påvisning af diarréfremkaldende patogener, idet vi sammenlignede PCR-resultaterne med mikroskopi, som i Guinea-Bissau er den gængse diagnosticeringsmetode. Vi demonstrerede, at PCR-tilgangen havde højere sensitivitet end mikroskopi til trods for, at prøverne i varierende perioder havde været opbevaret under tropisk høje temperatur i Guinea-Bissau. Forklaringen ligger dels i den øgede følsomhed ved PCR, som i øvrigt er uafhængig af observatør-varians, dels i at påvisning af patogene agens i prøver fra patienter med diarré ved mikroskopi er vanskelig. Hvis patienten har diarré, kræver påvisning af G. lamblia optimalt en frisk varm prøve, hvilket ikke er praktisk muligt under relativt primitive forhold som i Guinea-Bissau. Mikroskopisk påvisning af Cryptosporidium spp. kræver specialfarvninger, som ikke foretages rutinemæssigt. 

Brug af filterpapir til at undersøge tarmmikrobiota
Filterpapir anvendes således i stigende grad til PCR-baseret påvisning af patogener, eksempelvis til epidemiologiske studier, i områder, hvor det ikke er muligt at nedfryse prøver eller analysere dem hurtigt efter indlevering. På tilsvarende måde har man de seneste år undersøgt, om prøver opbevaret på filterpapir kan anvendes til undersøgelse af tarmens mikrobiota. Tarmmikrobiota, det vil sige den samlede mængde mikroorganismer i tarmsystemet, er i stigende grad blevet anerkendt som havende enorm indflydelse på værtens helbred, og er blandt andet koblet sammen med både gastrointestinale, kardiovaskulære, respiratoriske og psykiatriske sygdomme.9,10 

Traditionelt har man fokuseret på den bakterielle mikrobiota, da forekomsten af bakterier i tarmen suverænt overgår forekomsten af eksempelvis svampe, vira og arkæer. Fælles for langt størstedelen af studier af tarmens mikrobiota er, at prøvematerialet er blevet frosset ned øjeblikkeligt, og opbevaret ved -80°C forud for DNA-ekstraktion og -sekventering. Jævnfør betragtningerne ovenfor er dette ikke altid muligt, især ved feltarbejde og forskning i lavindkomstlande. 

Der findes en del studier, der debatterer optimal opbevaring af fæcesprøver til mikrobiota-forskning, herunder brugen af filterpapir.11-16 Fælles for disse studier er, at der ikke demonstreres nogle markante ændringer i kompositionen af tarmmikrobiotaen ved opbevaring ved stuetemperatur i op til otte uger sammenlignet med hurtigt nedfrosne prøver.

Konklusion

Der er en stigende opmærksomhed på, at tørrede fæcesprøver kan anvendes i mikrobiologisk forskning indenfor eksempelvis tarmmikrobiota, men også i diagnostikken i det kliniske arbejde. Dette kan eksempelvis muliggøre og lette kortlægning af ætiologien til diarré både i ressourcefattige områder, men også i populationsstudier i industrialiserede lande, for eksempel af asymptomatiske bærertilstande med Cryptosporidium spp.17 

Interessekonflikter: Ingen

Referencer

1. GBD Diarrhoeal Diseases Collaborators. Estimates of global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of diarrhoeal diseases: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet Infect Dis 2017;17:909-948. 2. Espy MJ, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol Rev 2006;19:165-256. 3. Verweij JJ, Stensvold CR. Molecular testing for clinical diagnosis and epidemiological investigations of intestinal parasitic infections. Clin Microbiol Rev 2014;27:371-418. 4. Liu J, et al. Optimization of Quantitative PCR Methods for Enteropathogen Detection. PLoS ONE 2016;11:0158199. 5. Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J Clin Lab Anal 2002;16:47-51. 6. Grimes KA, et al. PCR-based assay using occult blood detection cards for detection of diarrheagenic Escherichia coli in specimens from U.S. travelers to Mexico with acute diarrhea. J Clin Microbiol 2008;46:2227-2230. 7. Alberer M, et al. Detection of Gastrointestinal Pathogens from Stool Samples on Hemoccult Cards by Multiplex PCR. Can J Infect Dis Med Microbiol 2017;3472537. 8. Mero S, et al. Multiplex PCR detection of Cryptosporidium sp, Giardia lamblia and Entamoeba histolytica directly from dried stool samples from Guinea-Bissauan children with diarrhoea. Infect Dis (Lond) 2017;49:655-663. 9. Lynch SV, Pedersen O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. N Engl J Med 2016;375:2369-2379. 10. Gilbert JA, et al. Current understanding of the human microbiome. Nat Med 2018;24:392-400. 11. Vogtmann E, et al. Comparison of Collection Methods for Fecal Samples in Microbiome Studies. Am J Epidemiol 2017;185:115-123. 12. Vogtmann E, Goedert JJ. Epidemiologic studies of the human microbiome and cancer. Br J Cancer 2016;114:237-242. 13. Wong WSW, et al. Collection of non-meconium stool on fecal occult blood cards is an effective method for fecal microbiota studies in infants. Microbiome 2017;5:114. 14. Blekhman R, et al. Common methods for fecal sample storage in field studies yield consistent signatures of individual identity in microbiome sequencing data. Sci Rep 2016;6:31519. 15. Sinha R, et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2016;25:407-416. 16. Song SJ, et al. Preservation Methods Differ in Fecal Microbiome Stability, Affecting Suitability for Field Studies. Systems 2016:1. 17. Skovgaard DM, Hartmeyer GN, Skov MN, Høgh SV, Kemp M. Cryptosporidium Species are Frequently Present But Rarely Detected in Clinical Samples From Children with Diarrhea in a Developed Country. Pediatr Infect Dis 2018;37:138-140.