Cellekulturer danner blod-hjerne-barrieren i laboratoriet

Karin Lauschke | Jul 2018 | Neurologi |

Karin Lauschke
ph.d.-studerende,
DTU Fødevareinstituttet,
DTU Nanotech,
Institut for Mikro- og Nanoteknologi,
Danmarks Tekniske Universitet

Camilla Lindgren Schwartz
ph.d.-studerende,
DTU Fødevareinstituttet,
Danmarks Tekniske Universitet

Viden om blod-hjerne-barrierens komposition og gennemtrængelighed er essentiel for udviklingen af lægemidler, der skal kunne nå hjernens celler, men også for forskning i neurodegenerative sygdomme. Studier indikerer nemlig, at der er sammenhæng mellem intaktheden af blod-hjerne-barrieren og sygdomme som eksempelvis vaskulær demens, multipel sklerose og Alzheimers sygdom.1-4 Hvorvidt nedbrydning af blod-hjerne-barrieren er årsag eller konsekvens vides ikke. 

Til at undersøge blod-hjerne-barrieren kræves gode modeller, der kan laves i laboratoriet. Det kan enten være dyremodeller eller modeller baseret på celler groet i kulturskåle – såkaldte in vitro modeller. Denne artikel giver et overblik over forskellige eksisterende modeller, samt hvad der skal til for, at vi i fremtiden kan udvikle fysiologisk relevante modeller af blod-hjerne-barrieren. 

Blod-hjerne-barrierens komposition
Blod-hjerne-barrieren er en tæt barriere, der adskiller hjernemiljøet fra blodsystemet. Den består af flere forskellige celletyper, der tilsammen har til opgave at selektere, hvilke stoffer der får lov at passere fra blodet og ind i hjernen for at sikre det helt unikke miljø, der kræves for, at hjernens celler kan fungere optimalt. Blod-hjerne-barrierens unikke tæthed og selektive permeabilitet skyldes tre forskellige celletyper. 

Det basale cellelag udgøres af specialiserede endothelceller. Disse celler udtrykker særlige proteinkomplekser (tight junctions og adherens junctions) på deres laterale overflade, hvilket har til funktion at binde cellerne tæt sammen og derved skabe en fysisk barriere, der forhindrer molekyler i at passere imellem cellerne fra blodet og ind i hjernevævet. I stedet må molekylerne passere igennem cellerne ved hjælp af forskellige aktive transportmekanismer, der sørger for selektivt at transportere eksempelvis næringsstoffer ind i hjernen og affaldsstoffer ud af hjernen. 

Tæt om endothelcellerne findes pericytter og astrocytter, der ved hjælp af signalstoffer regulerer aktiviteten af endothelcellerne og derved blod-hjerne-barrierens gennemtrængelighed. Alle tre celletyper er derfor nødvendige for at opretholde den tætte og selektive barriere, og derfor er det vigtigt, at modeller af blod-hjerne-barrieren indeholder alle tre celletyper i et naturligt forhold. 

I laboratoriet måles tætheden af barrieren blandt andet som den transendothele elektriske modstand (transendothelial electrical resistance; TEER),5 som kan måles med to elektroder på hver side af endothelet. Hos raske er blod-hjerne-barrierens TEER omkring 5000 Ωcm2; en værdi man aldrig har opnået i in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren.6 

Den gode blod-hjerne-barriere-model
Der findes talrige in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren, fra simple modeller med et enkelt lag af endothelceller til komplekse tredimensionale strukturer med flere forskellige celletyper. Valget af model styres af, hvad man ønsker at undersøge. Man kan dog generelt sige, at fire egenskaber er særligt vigtige for kvaliteten af en blod-hjerne-barriere-model: 

Den skal have en høj tæthed.
Den skal udtrykke funktionelle og fysiologisk relevante transportproteiner.
Den skal have fysiologisk arkitektur.
Det er en fordel, hvis kulturen af cellerne er simpel.4

I det følgende tager vi udgangspunkt i de fire egenskaber i en beskrivelse af de vigtigste typer af blod-hjerne-barriere-modeller. De forskellige modeller kan både variere i setup og i celletypekomposition. For at læse om flere modeltyper samt en vurdering af disse henviser vi til Lauschke et al. 2017.6

Den simple model
Den mest simple model af blod-hjerne-barrieren bruger én endothelcellelinje ad gangen, samt det såkaldte trans-well system. Trans-well systemet er optimalt til at undersøge tætheden af blod-hjerne-barrieren. Systemet består af en lille cellekulturskål med en filterindsat, der inddeler kulturskålen i en øvre og nedre del. Endothelcellerne gror på filterindsatsen og vil efter nogle dage danne et cellelag, der minder om det, som naturligt findes i blod-hjerne-barrieren. Herefter kan man måle TEER og undersøge forskellige stoffers diffusion imellem de to dele af kultursystemet. 

I den mest anvendte trans-well model af blod-hjerne-barrieren bruges endothelcellelinjer, som for eksempel den humane cellelinje hcmec/D3.7,8 Selv om modellen er simpel, hurtig og reproducerbar, giver den kun TEER-værdier omkring 300 Ωcm2.8 En måde at forbedre tætheden på har været at udvikle co- og tripelkulturer, der inkluderer astrocytter og/eller pericytter i trans-well systemet sammen med endothelcellerne. 

Forbedrede modeller
Et vigtigt aspekt er, hvor celler kommer fra. Det kan være immortaliserede cellelinjer, primære celler eller celletyper deriverede fra stamceller, og cellerne kan enten komme fra dyr eller mennesker. Der er mange ligheder mellem de mammale cellelinjer, og derfor gør utallige studier brug af cellelinjer fra eksempelvis mus eller grise. Hvis formålet er at lave en model for den humane situation, vil man dog alligevel sidde tilbage med spørgsmålet om, hvor store forskellene mellem arterne egentlig er. Derfor er der stor interesse i at bruge humane celler, når dette er muligt.

Der er flere forskellige kilder til humane celler, men især de senere år har pluripotente stamceller (PSC) været af særlig interesse. Det skyldes, at PSC’er er udifferentierede celler, der har potentialet til at give ophav til alle kroppens celletyper. Det giver mulighed for at danne de relevante humane celletyper, der findes i blod-hjerne-barrieren.

Modeller af blod-hjerne-barrieren, som gør brug af celler deriveret fra PSC’er, har vist sig at være mere fysiologiske. De udtrykker alle de vigtige transportproteiner, udvikler tight junctions og opnår TEER-værdier på nogle tusinde Ωcm2. Ulempen ved disse modeller er, at processen, hvor stamcellerne eksperimentelt stimuleres til at danne de ønskede celletyper, er kompliceret og tidskrævende, fordi den kræver fremragende protokoller, stor ekspertise og gode kontroller for at sikre, at man har produceret den rigtige celletype. 

I de senere år har man imidlertid gjort store fremskridt, og det er nu muligt at producere blod-hjerne-barrierens tre celletyper – endothelceller, astrocytter og pericytter – samt at bruge disse i en trans-well blod-hjerne-barriere-model.9-12 En enkelt forskningsgruppe er lykkedes med at skabe en blod-hjerne-barriere-model med alle tre celletyper deriverede fra pluripotente stamceller, og samtidig opnå høje TEER-værdier med trans-well systemet.10,11 Desværre er det indtil nu ikke lykkedes at reproducere resultaterne i andre laboratorier. 

Udover cellernes oprindelse og kombinationen af forskellige celletyper kan man også skelne mellem modeller, der gør brug af todimensionelle (2D) eller tredimensionelle (3D) cellekulturer. 2D cellekulturer udgøres af celler, der gror i et enkelt lag, hvorimod 3D cellekulturerne udgøres af celler, der gror i flere lag eller i et komplekst 3D matrix. Den mest anvendte form for 3D cellekultur udgøres af flere lag celler arrangeret i såkaldte hydrogeler som eksempelvis kollagen eller gelatine. 

Hydrogeler består af polymere, der er opløst i vand, og de har til funktion at imitere cellens fysiologisk strukturelle omgivelser. Blod-hjerne-barrierens celler, der normalt findes i det bløde hjernevæv, har således behov for et andet omgivende miljø end knogleceller, der normalt findes i mere stive omgivelser. En anden vigtig egenskab ved hydrogelerne er deres evne til at inkorporere vækstfaktorer, signaleringsmolekyler og andre aktive stoffer på en måde, der imiterer det miljø, som omgiver cellerne in vivo. Ikke overraskende har 3D cellekulturer vist sig at være mere relevante for den fysiologiske situation end 2D cellekulturerne.13 Man har i de senere år gjort store fremskridt i udviklingen af hydrogeler, specielt til at forbedre kultur af pluripotente stamceller og de herfra deriverede celletyper. 

Håbet er, at hydrogeler skal hjælpe til at integrere endothelceller, pericytter og astrocytter i en 3D struktur, der ligner den, som disse celletyper findes i in vivo, og at dette kan forbedre fremtidens modeller af blod-hjerne-barrieren. Disse 3D strukturer kan bruges i trans-well systemet, men der findes også mange andre systemer til at arrangere cellerne. Dem vil vi dog ikke komme nærmere ind på her.

Konklusion

Der er mange modeller at vælge imellem, men det væsentlige er, at man vælger den model af blod-hjerne-barrieren, der bedst kan belyse det problem, man undersøger. Vil man undersøge, hvordan forskellige sygdomme påvirker tætheden af blod-hjerne-barrieren, har man brug for at måle TEER, og det gøres bedst i trans-well systemet. Det samme gælder, hvis man vil analysere hvilke stoffer, der er i stand til at passere blod-hjerne-barrieren, eksempelvis i forbindelse med udvikling af lægemidler, der skal virke i hjernen. 

Valget af celletype kan for eksempel afhænge af, hvad man ønsker at studere. Vil man eksempelvis undersøge genetiske sygdomme, er PSC’er et godt valg, da de kan deriveres fra patienter med genetisk nedarvede sygdomme. Er man på den anden side interesseret i at opnå mere generel viden, kan kommercielle cellelinjer give mulighed for simpel cellekultur og reproducerbare resultater.

Referencer

1. Freude K, Pires C, Hyttel P, Hall VJ. Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Alzheimer’s Disease Patients: The Promise, the Hope and the Path Ahead. J Clin Med 2014;3(4):1402-1436.  2. Winkler EA, Nishida Y, Sagare AP, et al. GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer’s disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration. Nat Neurosci 2015;18(4):521-530. 3. Bell RD, Winkler EA, Singh I, Sagare AP, Deane R. Apolipoprotein E controls cerebrovascular integrity via cyclophilin A. Nature 2012;495:512-516.  4. Krizbai IA, Wilhelm I. In Vitro Models of the Blood–Brain Barrier for the Study of Drug Delivery to the Brain. Mol Pharm 2014;11(7):1949-1963. 5. Srinivasan B, Kolli AR, Esch MB, Abaci HE. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom 2015;20(2):107-126.  6. Lauschke K, Frederiksen L, Hall VJ. Paving the Way Toward Complex Blood-Brain Barrier Models Using Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Dev 2017;26(12):857-874. 7. Weksler BB. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J 2005;19(13):1872-1874.  8. Weksler B, Romero IA, Couraud P-O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS 2013;10(1):16.  9. Lippmann ES, Azarin SM, Kay JE, et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2012;30(8):783-791.  10. Lippmann ES, Shusta E V, Azarin SM, Palecek SP, Al-Ahmad A. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep 2014;4:4160.  11. Canfield SG, Stebbins MJ, Morales BS, et al. An Isogenic Blood-Brain Barrier Model Comprising Brain Endothelial Cells, Astrocytes and Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J Neurochem 2016;140(6):874-888.  12. Yamamizu K, Iwasaki M, Takakubo H, et al. In Vitro Modeling of Blood-Brain Barrier with Human iPSC-Derived Endothelial Cells, Pericytes, Neurons, and Astrocytes via Notch Signaling. Stem Cell Reports 2017;8:1-14.  13. Benton G, Kleinman HK, Arnaoutova IP, George J. Advancing science and technology via 3D culture on basement membrane matrix. J Cell Physiol 2009;221(1):18-25.