Formodede cancer-stamcelle­mar­kører og deres relation til progression af malignt melanom

Formodede cancer-stamcelle­mar­kører og deres relation til progression af malignt melanom

Patricia Switten Nielsen | Mar 2018 | Dermatologi |

Patricia Switten Nielsen
cand.scient.med, ph.d.,
Patologisk Institut,
Aarhus Universitetshospital

Malignt melanom er karakteriseret ved et højt metastatisk potentiale og en udtalt resistens mod adjuverende behandling, om end nye typer af immunte-rapi tegner lovende for nogle patientgrupper.1

Desuden kan maligne melanomer, i visse tilfælde, være særdeles vanskelige at skelne fra benigne nævi. Patologens vurdering kræver stor erfaring, og der findes ingen entydig metode, der med sikkerhed kan adskille disse vanskelige læsioner. Vurderingsfejl er derfor forholdsvis hyppige og kan have alvorlige konsekvenser for den enkelte patient. Tal fra USA viser, at den hyppigste årsag til sagsanlæg mod patologer er oversete tilfælde af malignt melanom.2

Nylige studier har indikeret en eventuel eksistens af cancer-stamceller i modermærkekræft. I denne tumormodel besidder kun én celle-subgruppe evnen til evig selvfornyelse. Mens de reproducerer sig selv, giver de ophav til andre kloner af tumorceller, der, i modsætning, kun kan proliferere og differentiere til andre celletyper i et begrænset omfang. Cancer-stamcellernes evne til at optræde hvilende eller lavt prolifererende formodes at være en mulig årsag til de maligne melanomers resistens overfor konventionel kemoterapi, som er målrettet celler i deling.3,4

Modsat cancer-stamcelle modellen antager den traditionelle model, at alle tumorceller, alt afhængig af deres mutationsstatus, har samme mulighed for proliferation og differentiation.3 Hvilken model, der aktuelt driver væksten af en tumor, er dog stadig uvist, og begge modeller kan formentlig eksistere både mellem tumorer og i samme tumor.

Via studier på mus og cellelinjer har overfladeproteinerne CD271, CD166 og CD20 været benævnt som eventuelle cancer-stamcellemarkører.3,5,6 Disse kan påvises ved hjælp af immunhistokemi, men kun få studier er udført på patienters melanocytære læsioner.

CD271 er en receptor for en gruppe af nervevækstfaktorer, og den er udtrykt på celler af neural oprindelse, såsom melanocytter. Receptoren regulerer apoptose af nerveceller, men meget lidt er kendt om dens funktion uden for nervesystemet.7 CD166 er et celleadhæsionsmolekyle, der formodes at være tilstede på mesenkymale stamceller. Som den eneste markør umiddelbart, har CD166 demonstreret en uafhængig prognostisk værdi for patienter med modermærkekræft.6 CD20 er mest kendt som en lymfocyt-markør, men en subgruppe af melanomceller synes ligeledes at udtrykke dette overfladeprotein. Anti-CD20 terapi har desuden vist lovende resultater for metastatisk sygdom, om end i et meget lille studie.5

Da proliferation er et karakteristisk kendetegn for kræft og en vigtig prognostisk markør ved modermærkekræft,1 var studiets hypotese, at proliferationsindekset for disse formodede tumor-initierende cancer-stamceller kunne være indikativ for sygdommens aggressivitet i tillæg til blot deres tilstedeværelse. Studiets formål var således at undersøge sammenhængen mellem recidiverende sygdom og prolifererende CD271+, CD166+ og CD20+ tumorceller hos patienter med malignt melanom og undersøge markørernes ekspression i nævi, melanomer og recidiverende sygdom.

Materialer
30 patienter med recidiverende sygdom (cases) blev parret med 30 patienter uden recidiverende sygdom (kontroller) på væsentlige prognostiske parametre (tumortykkelse, ulceration, Clark level, histologisk subtype, lokalisation samt patientens alder og køn). Formalinfikseret, paraffinindstøbt væv fra disse patienters primære tumor (n=60), et eventuelt benignt nævus (n=17) samt tilbagefald hos cases (n=21) blev inkluderet. De maligne melanomer blev diagnosticeret i perioden 1992-1996. Den mediane opfølgningstid var derfor omkring 20 år for både nævi og melanomer. 

Metoder
Fire konsekutive vævsnit fra hver vævsblok blev skåret og farvet ved hjælp af immunhistokemi. Enkelt-farvninger for CD271, CD166 og CD20 samt en dobbelt-farvning for Ki67/Melan-A (henholdsvis proliferations- og melanocyt-markør) blev udført. Mikroskopi-glas blev scannet, og de fire digitale billeder blev lagt ovenpå hinanden ved hjælp af kommercielt software, således de udgjorde en såkaldt virtuel farvning. Herved kan flere farvninger vurderes i forhold til hinanden på celle-til-celle niveau. De virtuelle farvninger blev kvantiteret ved hjælp af digital billedanalyse (figur 1). For maligne melanomer blev melanocytternes proliferationsindeks beregnet for hele tumor og for hver cancer-stamcellemarkør. Desuden blev deres procentmæssige andel i enten epidermis, i forhold til melanocytterne i dermis eller i metastatisk væv beregnet.

Resultater 

Proliferationsindeks for alle tumorceller samt henholdsvis CD271+, CD166+ og CD20+ tumorceller fremgår af tabel 1. Der blev ikke observeret forskelle i den procentmæssige andel af markørerne i henholdsvis epidermis eller dermis for melanom cases og kontrolpersoner (P >0,11).

Patienternes nævus havde i alle tilfælde en højere procentmæssig ekspression af CD271 i epidermis end det maligne melanom (tabel 2). De udtrykte CD271 langs det basale lag af epidermis (i keratinocytterne), mens dette mønster enten var helt væk eller forstyrret i alle melanomerne. CD166 udviste en særlig diffus farvning af hele epidermis ved de maligne melanomer, som oftest ikke var tilstede i nævi (figur 2). Den procentmæssige ekspression af de to markører for både epidermis og dermis fremgår af tabel 2.

Alle metastaser indeholdt CD271+ melanocytter, mens kun ca. halvdelen indeholdt CD166+ melanocytter. Der blev ikke påvist CD20+ melanocytter i hverken metastaser eller nævi, og det samme gjorde sig gældende for halvdelen af melanomerne.8

Diskussion

Prolifererende CD271+ tumorceller var, som den eneste celletype, korreleret med forekomsten af recidiverende sygdom i dette studie. Herudover var CD271+ tumorceller, i modsætning til CD166+ og CD20+ tumorceller, tilstede i alle vævsprøver med recidiv, hvilket kan indikere et øget metastatisk potentiale af disse celler. Intet andet studie har undersøgt sammenhængen mellem prolifererende CD271+ tumorceller, og derfor har resultatet behov for yderligere validering.

I lighed med deres normale modpart betragtes cancer-stamceller ofte som lavt profilerende.3 Det var derfor overraskende, at de formodede cancer-stamceller havde et højere proliferationsindeks end den samlede tumormasse. Deres faktuelle proliferative status er dog aktuelt set ukendt eller utilstrækkeligt belyst.

Den observerede forskel for CD271 i nævi og melanomer var meget påfaldende i dette studie. Der syntes således at være en sammenhæng mellem keratinocytternes ekspression af CD271 i det basale lag og udviklingen af malignt melanom. Mekanismen bag dette forhold forekommer ukendt. Det er dog kendt, at den epidermale balance netop er styret af basale keratinocytter, der samtidig kontrollerer melanocyt-funktioner, som proliferation, differentiation og melanogenese blandt andet ved hjælp af vækstfaktorer.9 Her kan CD271 spille en væsentlig rolle i form af dens eventuelle sammenhæng med programmeret celledød.7

Når der forekommer en forstyrrelse i keratinocytternes CD271 udtryk eller i disses mikromiljø, kan dette eventuelt give grobund for en uhensigtsmæssigt proliferation af potentielle melanomceller. Den observerede forskel har aldrig tidligere været påvist i nævi og melanomer. Dog har et studie vedrørende psoriasis, der netop er karakteriseret ved hyper-proliferation af keratinocytter, vist, at CD271 ekspressionen i epidermis tabes på helt samme vis.10 Yderligere undersøgelse af markørens diagnostiske potentiale, specielt ved særligt vanskelige melanocytære læsioner, kan vise sig interessant.

Om end der blev observeret en statistisk signifikant forskel mellem nævi og melanomer for CD166 i dette studie, var der et betydeligt overlap mellem læsionerne. Stort set samme resultat har gjort sig gældende i andre studier.11 Farvningerne var desuden generelt set vanskelige at vurdere, da de ofte var meget svage. CD166 kan dog stadig være et muligt diagnostisk hjælpeværktøj i tvivlstilfælde. Ingen andre har umiddelbart undersøgt det diagnostiske eller prognostiske potentiale for CD20, men anvendeligheden heraf synes meget begrænset ud fra resultaterne af dette studie.

Konklusion

I dette case-kontrol studie var proliferationsindekset for CD271+ tumorceller korreleret med udviklingen af recidiverende sygdom hos patienter med malignt melanom i modsætning til proliferationsindekset for alle tumorceller. På baggrund af flere undersøgelser kan disse celler være et muligt mål for terapi. Specielt tabet af CD271+ keratinocytter i epidermis syntes at være forbundet med udviklingen af malignt melanom. Dette kan ved mulig validering give anledning til et nyt diagnostisk værktøj ved melanocytære læsioner.

Referencer

1. Gershenwald JE, Scolyer RA, Hess KR, et al. Melanoma staging: Evidence-based changes in the American Joint Committee on Cancer eighth edition cancer staging manual. CA Cancer J Clin 2017 Nov;67(6):472-492. 2. Kornstein MJ, Byrne SP. The medicolegal aspect of error in pathology: a search of jury verdicts and settlements. Arch Pathol Lab Med 2007 Apr;131(4):615-618. 3. Schatton T, Frank MH. Cancer stem cells and human malignant melanoma. Pigment Cell Melanoma Res 2008 Feb;21(1):39-55. 4. Sabatino M, Stroncek DF, Klein H, Marincola FM, Wang E. Stem cells in melanoma development. Cancer Lett 2009 Jul;279(2):119-125. 5. Pinc A, Somasundaram R, Wagner C, et al. Targeting CD20 in melanoma patients at high risk of disease recurrence. Mol Ther 2012 May;20(5):1056-1062. 6. Donizy P, Zietek M, Halon A, Leskiewicz M, Kozyra C, Matkowski R. Prognostic significance of ALCAM (CD166/MEMD) expression in cutaneous melanoma patients. Diagn Pathol 2015 Jul;10:86. 7. Pincelli C. p75 Neurotrophin Receptor in the Skin: Beyond Its Neurotrophic Function. Front Med (Lausanne) 2017 Mar;4:22. 8. Nielsen PS, Riber-Hansen R, Steiniche T. Immunohistochemical CD271 expression correlates with melanoma progress in a case-control study. Pathology 2018 (in press).  9. Hirobe T. Keratinocytes regulate the function of melanocytes. Dermatologica Sinica 2014;32:200-204. 10. Truzzi F, Marconi A, Atzei P, et al. P75 Neurotrophin Receptor Mediates Apoptosis in Transit-Amplifying Cells and its Overexpression Restores Cell Death in Psoriatic Keratinocytes. Cell Death Differ 2011 Jun;18(6):948-958. 11. Shanesmith RP, Smart C, Cassarino DS. Tissue microarray analysis of ezrin, KBA.62, CD166, nestin, and p-Akt in melanoma versus banal and atypical nevi, and nonmelanocytic lesions. Am J Dermatopathol 2011 Oct;33(7):663-668.